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Figura 2. A) Metafase obtenida mediante el método clásico y técnica FISH de los centrómeros y los telómeros. Se señalan dos cromosomas dicéntricos y dos fragmentos acéntricos; B) Metafase obtenida mediante el método clásico y técnica FISH de pintado de los cromosomas 2 (rojo), 4 (verde) y 12 (amarillo). Se señala una traslocación entre el cromosoma 4 y un cromosoma no hibridado. C) Extensión de PCC mediante fusión con células CHO y FISH de los centrómeros y los telómeros. D) Núcleos de linfocitos no estimula- dos, marcados con anticuerpos anti-g-H2Ax, se observa en forma de foci las roturas de doble cadena de ADN. núcleos. Los micronúcleos se forman durante la citoquinesis y están constituidos por material genético que no se ha segregado correctamente durante la división celular. El aná- lisis de micronúcleos es más rápido que el de dicéntricos, sin embargo, el rango de dosis que permite estimar es menor. Otra técnica que se propuso fue la condensación prematura de cromosomas (PCC). Esta técnica permite analizar las alte- raciones cromosómicas en etapas anteriores a la mitosis. La condensación prematura de cromosomas se puede realizar fusionando los linfocitos expuestos con células en división, en este caso células CHO. La fusión celular provoca que el factor promotor de la maduración de las células CHO con- desen los cromosomas del linfocito. Esto permite el análisis de linfocitos justo después de su extracción (PCC-G0), obte- niendo resultados más rápidamente. La técnica de PCC-G0 es laboriosa y requiere el mantenimiento constante de la línea celular en crecimiento. Mediante PCC-G0 y aplicando técnicas de tinción uniforme se pueden analizar cromosomas en anillo o el exceso de fragmentos acéntricos (Figura 1C). Si se aplican técnicas de FISH, en este caso utilizando sondas que marcan todos los centrómeros y todos los telómeros, se pueden analizar también cromosomas dicéntricos y cromo- somas en anillo (Figura 2C). Esta técnica también se puede utilizar para detectar cromosomas dicéntricos en metafase (Figura 2A). Si bien el laboratorio de la Universidad Autóno- ma de Barcelona (UAB) tiene a punto esta técnica, hasta el momento solo la ha utilizado para estudiar la dinámica de las alteraciones cromosómicas durante el ciclo celular (Pujol y col, 2020). Una de las limitaciones del análisis convencional de dicén- tricos es la estimación de dosis muy elevadas, más de 5 Gy, ya que por encima de estas dosis los linfocitos muestran retraso o incluso imposibilidad para llegar a la mitosis. Esto dificulta realizar un análisis de dosimetría biológica en el que la incertidumbre asociada a la dosis estimada sea lo suficientemente acotada. Para poder estimar dosis elevadas se proponen diversas aproximaciones: la condensación pre- matura de cromosomas mediante la utilización de productos químicos; y la inhibición de los puntos de control del ciclo celular. Se pueden obtener cromosomas prematuramente condensados utilizando agentes químicos como la Caliculi- na-A o el ácido Okadaico, estos provocan la activación del factor promotor de la maduración, pero este factor solo se encuentra en células en división. Por lo tanto, para realizar PCC con productos químicos los linfocitos se deben de cul- tivar. Esta técnica se denomina PCC-G2, y permite analizar los cromosomas cuando las células están en la fase G2 del ciclo celular (Figura 1D). La técnica de PCC-G2 se utilizó con éxito para estimar la dosis de los individuos afectados en el accidente de criticidad de Tokai-mura, en el que el operador más expuesto recibió una dosis a cuerpo entero de unos 20 Gy. La posibilidad de estimar dosis muy elevadas también permite a la dosimetría biológica mejorar la estimación de irradiaciones parciales o muy focalizadas a dosis muy eleva- das. Mediante esta metodología, el laboratorio de dosime- tría biológica de la UAB ha construido curvas de calibración de 0 a 20 Gy. Otra metodología que se propone para realizar dosimetría biológica a dosis muy elevadas es la utilización de inhibidores de los puntos de control del ciclo celular. Tras la exposición a las RI el daño genético inducido tiende a repararse, pero si no se repara o se repara erróneamente las células ralentizarán su crecimiento o incluso no crecerán. Esto se debe a la existencia de puntos de control del ciclo celular que permiten la continuación de la división celular teniendo en cuenta la integridad del material genético. Para el daño genético producido por las RI, el punto de control más importante es el que permite a los linfocitos pasar de la fase G2 y entrar en mitosis (G2/M). La utilización de inhibi- dores de este punto de control, como la cafeína, permiten a las células altamente dañadas llegar a metafase (Figura 1B), y por lo tanto aumenta el número de células analizables. Mediante esta metodología se han construido curvas de calibración de 0 a 25 Gy (Pujol y col 2013). Más allá del análisis de alteraciones cromosómicas, se han propuesto otros biomarcadores basados en la detección de la respuesta celular inicial frente al daño genético inducido. Entre ellos el más aceptado es la detección de las roturas de doble cadena en el ADN. Inmediatamente después de la inducción de roturas, centenares de moléculas de la his- tona H2AX se fosforilan (g-H2AX). La presencia de g-H2AX DOSIMETRÍA BIOLÓGICA. EXPERIENCIA DE LOS LABORATORIOS ESPAÑOLES 47 Colaboraciones